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DIA定量蛋白質組學

DIA定量蛋白質組學

  • 所屬分類:定性/定量蛋白質組學
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  • 發布日期:2021-01-04 14:05:21
  • 產品概述
  • 案例解析

DIA技術(data-independent acquisition,數據非依賴采集)融合了傳統蛋白質組shotgun的高通量和質譜定量金標準PRM的定量準確的優點,被Nature Methods雜志評為2015年最值得關注的技術。


技術原理

傳統的蛋白質組技術shotgun、Label free、iTRAQ/TMT等在數據采集過程中存在較高的數據丟失和采集的隨機性即DDA(data-dependent acquisition)的采集方式。在這個采集過程中,每個掃描周期內, 質譜只對豐度較高的信號進行二級信號采集,其余信號的二級信號則丟失了。

而DIA(data-independent acquisition)技術原理是將所有的信號預先劃分為幾塊,然后對每塊區域里面的所有一級信號,全部一次性進行二級采集。從而實現了高度的覆蓋性,以及在此基礎上的高度重現性。

DIA模式下的信號采集窗口展示


DIA技術優勢

1. 穩定性好:與傳統的DDA采集模式相比,是無偏好的全息掃描,獲得的信息全面,解析出的蛋白較普通LFQ方法多,穩定性更好,缺失值相對較少。

2.定量準確度高:定量準確度與PRM技術相當。

3.適用范圍廣:單個樣本上機,能進行一定程度上的有或無鑒定,能用于不同組織類型蛋白表達譜的比較。

4.時間跨度大:樣本中加入了保留時間校正的標準肽段,不受上樣時間限制,能夠對不同時間上機的樣本進行保留時間校正后,進行整體數據分析,更適合大樣本量,疾病類樣本。


實驗流程

DIA定量蛋白組學案例解析


血清蛋白質組學鑒定銀屑病及其中藥療效的生物標志物

In-depth serum proteomics reveals biomarkers of psoriasis severity and response to traditional  Chinese medicine


研究對象:血清          期刊:Theranostics

影響因子:8.712         發表單位:國家蛋白質中心



研究背景

血清和血漿含有豐富的生物學信息,可以反映人體的生理和病理狀況,因此是疾病生物標記物的寶貴樣本類型。但是,由于血清中蛋白質的濃度范圍很廣,因此對血清蛋白質組進行全面的分析具有挑戰性.為解決這一挑戰,作者通過將DIA-MS與可定制的抗體微陣列相結合,開發了一個深入的血清蛋白質組學技術平臺,全面測定銀屑病患者的血清蛋白質組將有助于更好地了解銀屑病的發病機理,并確定診斷和治療的生物標志物.

樣本策略:銀屑病患者血清和健康対照血清

技術策略:抗體微陣列,DIA

驗證策略:ELISA


結果速遞

1、通過文獻挖掘,共找到129種與銀屑病相關的血液蛋白?;谶@些蛋白的抗體制作抗體微陣列,對16例健康人血清、23例銀屑病患者血清、11例經12周銀屑靈治療的銀屑病患者血清進行蛋白質檢測, 發現抗體微陣列檢測血清蛋白的重現性較高。對比銀屑病患者血清和健康人血清, 發現除了已知的銀屑病標志物外,還鑒定到新的在銀屑病患者血清中發生豐度變化的蛋白。

銀屑病特異的抗體微陣列


2、通過QE-HF質譜儀對各組血液樣本進行DIA檢測,共鑒定到283個特異性肽段。對DIA技術進行重復性評價,結果表明樣本間的Pearson相關系數均值為0.85,平均變異系數為4.17%。對銀屑病患者組和健康對照組進行比較發現58種差異蛋白,其中有已知的炎癥和凝血相關蛋白。

DIA檢測銀屑病患者血清蛋白


3、經過生物信息學統計分析與臨床指標的相關性分析結果表明58個差異蛋白(P <0.01)可顯著區分銀屑病患者和健康對照,基于這些差異蛋白進行主成分分析,也同樣可區分兩組,其中一個蛋白PFN1在DIA和抗體兩種技術的定量結果中,均在銀屑病患者和健康對照組中有顯著差異。在發現集和獨立驗證集中,用

ELISA技術對PI3進行驗證,結果均表明其在銀屑病患者組中高表達。說明其找到的差異蛋白可能成為銀屑病的潛在標志物。進而選取了11例銀屑病患者,經12周的銀屑靈治療,結果有6例患者治療有效,5例患者治療無效。對藥物治療前的治療有效組(n = 6)和治療無效組(n = 5)患者血清蛋白進行比較分析,發現了12種差異表達的蛋白(p<0.05)。對這些蛋白在治療后的表達值進行檢測,發現有效組中FCN2,MIF和MMP1的血清豐度一致高于無效組,表明其可作為預測銀屑靈治療效果的潛在生物標志物。


血液中包含了豐富的生理、病理信息,是疾病生物標志物研究領域的重要材料。然而血液蛋白濃度動態范圍廣、高豐度蛋白含量高,導致血液蛋白質組鑒定難度大。本文通過DIA技術和抗體微陣列技術,以銀屑病為疾病模型,對銀屑病治療前、銀屑病中藥(銀屑靈)治療后、健康對照共50例血清樣本建立蛋白質表達譜。鑒定到了106種參與血液凝固、炎癥、細胞凋亡和血管生成等銀屑病相關生物過程的差異蛋白。聚類和主成分分析發現58種蛋白可區分健康組和銀屑病患者,12種蛋白可預測中藥治療效果,相關性分析發現三個血清蛋白( PI3,CCL22,IL-12B)與銀屑病面積和嚴重程度指數( psoriasis area and severity index,PASI)評分呈正相關。質譜DIA技術適合大規模臨床樣本的檢測,抗體微陣列技術可補充質譜無法鑒定到的血清低豐度蛋白,本文結合DIA技術和抗體微陣列技術互相彌補對方缺點,使鑒定多的蛋白數量最大化。


參考文獻

Xu M, Deng J, Xu K, et al. In-depth serum proteomics reveals biomarkers of psoriasis severity and response to traditional Chinese medicine[J]. Theranostics, 2019, 9 (9): 2475-

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