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「青蓮百奧聚焦」甜蜜的負擔——O-GlcNAc

2021-03-17 00:00:00

蛋白質的糖基化是一種最常見的蛋白翻譯后修飾,是在糖基轉移酶作用下將糖類轉移至蛋白質和蛋白質上特殊的氨基酸殘基形成糖苷鍵的過程。研究表明70%人類蛋白包含一個或多個糖鏈1%的人類基因組參與了糖鏈的合成和修飾。

哺乳動物中蛋白質的糖基化類型主要可分為兩種:N-糖基化和O-糖基化。而O-糖基化位點沒有保守序列,糖鏈也沒有固定的核心結構,組成既可以是一個單糖,也可以是巨大的磺酸化多糖,因此與N-糖基化相比,O-糖基化分析會更加復雜。

這么復雜難題該怎么辦呢?別擔心,青蓮百奧可承接復雜的O-糖基化分析,助您輕松解鎖O糖奧秘。下面小編給您分享一篇新發表的O糖基化修飾的高分應用文獻。


2021年3月3日,裴華東團隊、秦偉捷團隊以及賀福初院士團隊等合作在Molecular Cell雜志上在線發表了題為“Posttranscriptional Regulation of De Novo Lipogenesis by Glucose-Induced O-GlcNAcylation”的研究論文。該研究報道了O-GlcNAc修飾通過增強SRPK2的細胞核內定位、在轉錄后水平上調控腫瘤細胞的脂質從頭合成水平、進而促進腫瘤生長的新機制;這一調控依賴于importin α/β入核轉運系統,且進一步研究提示importin α蛋白可能是O-GlcNAc修飾的“reader”。


很多研究表明,O-GlcNAc糖基化參與調控細胞轉錄、信號轉導以及應激反應等多個生物學過程,與神經退行性疾病、糖尿病以及癌癥等人類重要疾病相關。O-GlcNAc糖基化修飾能感應細胞外的葡萄糖、脂肪酸等其他能量分子的水平,被人們視為一種潛在的“營養感受器”,近期研究也表明O-GlcNAc糖基化有可能積極的直接參與調控細胞代謝過程。在癌癥中,O-GlcNAc糖基化水平明顯升高,異常的O-GlcNAc跟癌細胞的增殖、侵襲以及轉移有關系。





結果速遞



HBP在轉錄后水平上影響新生脂肪形成

HBP(己糖胺生物合成途徑)是糖酵解的一個分支,負責生成UDP-GlcNAc,UDP-GlcNAc是蛋白O-GlcNAc修飾形成所需的糖基供體。為了研究HBP是否調節新生脂肪形成,研究人員通過在MCF7細胞中敲低HBP途徑中的限速酶谷氨酰胺-果糖6-磷酸轉氨酶1(GFPT1),證明了敲低GFPT1可以降低細胞中UDP-GlcNAc的含量。此外,通過在培養基中添加UDP-GlcNAc發現可恢復新生脂質的合成。這些研究證實了O-GlcNAc修飾可以調控細胞內脂質從頭合成水平以及相關基因mRNA的剪接、穩定性與表達水平。

圖1.HBP在轉錄后水平上影響新生脂肪形成


OGT介導O-GlcNAcylation,核易位和SRPK2激活

有研究表明SRPK2可以促進脂肪生成基因mRNA的穩定性和新生脂肪生成。因此,研究人員檢查了HBP是否通過SRPK2影響新生脂肪形成。通過CRISPR-Cas9技術生成了SRPK2敲除細胞,并比較了有無OGT敲除情況下這些細胞的新生脂肪生成。正如預期的那樣,SRPK2 KO MCF7細胞的新生脂肪形成受到損害,當OGT也被敲除時,這種損傷在這些細胞中也相似。研究表明,SRPK2和OGT在促進脂肪生成的途徑相同,但OGT通過影響SRPK2豐度的其他機制調節SRPK2。并且通過LC-MS / MS分析發現了S490、T492和T498是SRPK2上的主要O-GlcNAcylation位點。

圖2.OGT O-GlcNAcylates SRPK2并促進其核易位和激活


SRPK2 O-GlcNAcylation在核定位信號處誘導其與importin α/β的結合和核易位

在細胞中,importin α/β系統是調控蛋白入核的經典途徑,其中importin α蛋白的N端可以結合importin β蛋白,C端可以結合貨物蛋白的核定位序列(Nuclear-localization signal, NLS),從而形成三元復合物通過核孔將蛋白運入細胞核內。為了確認importin α結合SRPK2的O-GlcNAcylated NLS,研究人員合成了SRPK2 487至523殘基的肽。這些肽包含NLS和O-GlcNAcylation位點S490、T492和T498。通過在體外修飾這些肽以產生O-GlcNAcylated或未修飾的肽。使用表面等離子體共振(SPR)分析,確認了O-GlcNAcylated肽和importin α3之間的直接相互作用,但未修飾的肽與importin α3之間沒有直接的相互作用(圖4G)。這些結果表明O-GlcNAc修飾可以顯著增強SRPK2與importin α蛋白的相互作用,表明importin α可能是O-GlcNAc修飾的“reader”。

圖3.NLS處的SRPK2 O-GlcNAcylation誘導其與importin α/β的結合


OGT-SRPK2途徑與mTOR信號傳導途徑平行

之后,考慮到前人報道的mTORC1/S6K1介導的SRPK2的磷酸化修飾位點與鑒定到的糖基化位點相近,那么其與糖基化修飾之間是否存在相互影響呢?實驗表明,SRPK2糖基化修飾存在與否并不影響SRPK2 S494位點的磷酸化修飾。雷帕霉素是mTOR的抑制劑。在雷帕霉素處理的條件下,SRPK2糖基化修飾仍然能夠響應外界葡萄糖濃度的變化,進一步調控脂質的從頭合成水平。這些結果都提示了OGT介導的SRPK2 O-GlcNAcylation與mTORC1/S6K1通路是平行的。為了評估SRPK2 O-GlcNAcylation的病理作用,基于體內體外實驗證明了SRPK2糖基化修飾可以促進乳腺癌細胞的生長與增殖。

圖4.OGT-SRPK2途徑與mTOR信號傳導途徑平行


O-GlcNAcylation促進貨物蛋白與importin α結合并實現蛋白質的核輸入

最后,研究人員結合自有數據和已發表的數據庫信息,發現來自人類和小鼠的353種蛋白質在NLS里面或附近都存在O-GlcNAcylation位點。這些蛋白質參與多種關鍵的細胞過程,例如基因轉錄、蛋白質修飾和細胞凋亡等。從這些蛋白中,研究人員挑選了RELA與Sp1進行了基于COIP和pulldown的實驗驗證,結果證實了這些蛋白的糖基化修飾可以顯著增強其與相應importin α蛋白的相互作用,進而促進其在細胞核內的定位。



小結

總的來說,該研究一方面建立了O-GlcNAc修飾的實驗流程和質譜解析方法,為其他領域的O糖基化研究提供了方法學借鑒;同時揭示了O-GlcNAc修飾在轉錄后水平上調控腫瘤細胞脂質從頭合成與促進腫瘤生長的分子機制,且OGT-SRPK2通路平行于mTORC1-S6K1-SRPK2通路,提示OGT與mTORC1通路抑制劑的聯合使用可能對于相關腫瘤的治療具有更好的效果。

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期刊名稱:Molecular Cell

IF:15.584

樣本選擇:MCF7和HEK293T細胞系,小鼠模型

技術策略:糖基化蛋白質組學、代謝組學、全轉錄組測序等



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