蛋白質組學

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蛋白質組學,糖基化蛋白質組學,多組學聯合分析
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2021-03-01 00:00:00

由于蛋白質組學實驗非常復雜,因此很容易失敗,并且沒有明確的原因。使用標準的實驗設計技術并結合質量控制可以大大增加成功的機會。2017年,Methods in Molecular Biology期刊上在線發表了題為“Designing Successful Proteomics Experiments”的方法型研究論文。該文重點介紹了相關概念,并提供蛋白質組學工作流程的示例。將這些概念成功應用于蛋白質組學實驗是很簡單的。它可以幫助確定實驗失敗原因,并且大大增加實驗的可重復性。


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蛋白質組學旨在對復雜的生物學背景(例如組織和血漿)中的數千種蛋白質進行定量。通常在多個制備步驟(包括蛋白質提取、富集、分離和消化)之后,使用諸如質譜儀之類的靈敏儀器完成此操作。由于這些復雜的實驗室過程在整個研究過程中可能缺乏穩定性,因此,除非實驗旨在考慮這一點,否則它們會對結果產生負面影響。最近美國國立衛生研究院強調了實驗的可重復性,指出將對撥款申請進行專門審查,以“為獲得穩健和公正的結果而進行的嚴格實驗設計”為標準。因此,實驗設計不僅在執行研究中很重要,而且對于實驗經費的申請中也很重要。

 

蛋白質組學研究的7個關鍵步驟:


1.定義研究目標和相關的響應變量

首先要明確研究目標,包含以下問題:“您想要解決什么問題?”和“您將比較哪個樣本組?”明確這些響應變量。然后確定實驗方法,例如MRM(多反應監測)、DDA(數據依賴性采集),DIA(數據非依賴性采集)或其他方法之間進行決策。預估效應大小非常重要,因為這將有助于確定需要分析多少個樣本。對于早期生物標志物篩選,無論大小如何,任何顯著差異都可能令人感興趣。而在其他情況下,例如毒理學研究,只有生理上有意義的差異才有價值。

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圖1. 設計高效蛋白質組學實驗的主要步驟


2.列出相關因素

這些因素是指那些可能影響響應變量的事物。理想情況下,響應僅受實驗系統設計要測量的物理性能的影響。但是在實際操作中還會受到一些其他因素的干擾。例如,測得的肽段峰面積不僅取決于該肽的豐度,還取決于電噴霧的穩定性,色譜柱殘留量和蛋白水解的效率。消化效率可能反過來取決于胰蛋白酶試劑批號以及由哪個實驗室技術進行消化等。我們在實驗研究中更改的那些因素稱為實驗因素。例如,當比較亞細胞級分之間的蛋白質組時,蛋白質組級分(例如,細胞質或細胞核)就是這種因素。如果我們要測試色譜對峰高的影響,則流速可能是實驗因素。識別有害因素的目的是使它們對響應變量的影響最小化。



3.設定質量控制程序


設定質控樣本,質控樣本的目的是指出流程或設備何時發生故障,或者更好地向我們保證它們沒有發生故障。對質控樣品的測量應定量指示過程和設備的性能??梢詫⒍鄠€樣品用于QC不同的實驗步驟。例如,可以使用細胞裂解液或其他復雜混合物定期評估蛋白質分餾工作流程,并通過分餾物中的紫外線吸收給出定量數據??梢允褂煤唵蔚碾亩位旌衔餃y量LC-MS的性能,對肽和電荷狀態之間的峰面積以及反映污染或殘留的其他峰進行定量?;蛘?,可以在整個工作流程中定期運行從目標生物樣品中提取的QC樣品。



4.優化工藝


供應商提供的Protocols為實驗的關鍵部分提供了詳細的路線圖。但是,要使實驗系統整體正常運行,還需要調整許多參數。例如,安捷倫的噴射流電噴霧電離源具有六種調節功能,例如干燥氣體溫度、霧化器電壓和毛細管電壓等。



5.評估所需的樣本數


如果研究的樣本數量不足(缺乏足夠的獨立樣本或技術重復)則難以以高概率的情況來解釋研究的問題,這樣可能會導致錯誤的肯定結論或錯誤的否定結論。要創建可能會得到我們想要的效果的研究,我們必須評估需要多少樣本并相應地設計實驗。通過中試實驗測量噪聲水平(影響變量的一些因素)是設計中的關鍵步驟。建議從同一組(例如疾病,對照)中至少采集十個獨立的生物學樣本,以評估其差異性。這包括來自技術實驗方面的噪聲以及來自重復樣本之間生物學差異的噪聲。另外,應對同一種生物樣品進行處理和測量至少五次,以評估技術差異程度。盡管這些實驗似乎是一筆昂貴的投資,但它們提供的知識對于首次進行成功的實驗至關重要。



6.配置實驗


現代實驗設計可以追溯到R.A. Fisher于1926年首次發表的著作,他確定了實驗設計的三個基石:blocking、隨機化和復制(blocking、randomization和replication)。blocking和隨機化可消除有偏見的答案,復制可以提高信噪比,從而提高實驗結果的準確性。


a.Blocking

在實驗過程中,許多因素會對實驗造成影響。例如試劑批次、操作人員、上機時間等。其中一個因素的變化,都可能會對實驗結果產生影響。假如按這樣一個因素的水平將兩個樣本組分開(例如,所有實驗組的樣本都在一天之內上機檢測,而所有對照組的樣本則在另一天上機檢測),那么這些技術變化可能會被誤認為是生物學效應。其解決方案是使用blocking。對于一些變量因素會進行一個小的平衡實驗。例如,如果每天只能運行八個樣本,那么每天將運行兩個樣本組中的每個樣本組中的四個。響應變量的任何變化都將幾乎平等地影響兩組,從而避免可能導致的錯誤發現。當存在多個這樣的因素時,以平衡的方式解決設計可能是一項挑戰,特別是如果這些因素之間存在相互作用。當無法進行平衡設計時應使用隨機化。


b.隨機化

可能存在多種干擾因素,在這些干擾因素上不清楚如何平衡時,例如在設備或操作人員注意力變化的情況下,一天樣品的處理順序可以隨機化。蛋白質組學中的時間隨機化尤為重要,因為存在許多潛在的不穩定因素,包括LC色譜柱退化、電噴霧不穩定性、傳輸管堆積等。隨機化具有抵消因無法預知的影響而產生的誤差的額外優勢。

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圖2.蛋白質組學LC-MS工作流程的隨機化設計


c.復制

與試圖消除可能被誤認為或掩蓋實際效果的系統偏差的blocking和隨機化不同,復制的目的是減少隨機測量變量的影響。這樣可以更地闡述研究的問題。復制有兩種類型。通過重復地從群組中抽取獨立的隨機樣本,我們可以獲得對該群組的平均應答值(例如蛋白質表達水平)的越來越準確的估算,這是生物復制。此外,任何研究樣品都可以在實驗室中進行多次處理,并對結果取平均值以減少處理過程差異的影響,這是技術復制。


7.數據分析

分析步驟包括蛋白質鑒定、定量和統計分析。最常見的方法是t檢驗和ANOVA。對于blocking設計,必須確保在分析中考慮到blocking(以便在估算噪聲水平時忽略這些變量之間可能存在的巨大差異)。通??梢允褂梅讲罘治觯ˋNOVA )或混合效應模型(mixed effects models)中的blocking因子來實現。一般情況下,統計分析必須與研究問題和實驗設計相匹配。另外,對照樣品也必須進行分析。這些QC可以用于檢測不同因素之間(例如,跨天)的性能變化,以表征設備性能的變化。對陽性和陰性對照樣品的分析可以驗證整個實驗工作流程是否正常運行。



結 論

Oberg和Vitek指出:“如果不對實驗設計給予適當的關注,所有定量研究均無法提供可再現且準確的結果”。設計良好的實驗不會比設計不良的實驗花費更多的精力。然而,對于實驗的成功或了解實驗失敗的原因至關重要。R. A. Fisher確定的實驗設計中三個重要的基石是blocking、隨機化和復制。此外,通過建立適當的質量控制,可以有助于消除因一些系統因素而造成的實驗誤差。最后,鼓勵通過公共存儲庫(例如proteomexchange.org)共享蛋白質組學數據。它不僅減少了不必要的重復研究,而且使比較相似的數據集可以評估質量和準確性。盡管目前尚不存在用于LC-MS質量控制運行的標準,但將這些信息共享在一起的實驗數據有一天可以大大簡化調試和優化蛋白質組學實驗的過程。


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設計成功的蛋白質組學實驗

期刊名稱:Methods in Molecular Biology



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